97/647/EG: Entscheidung der Kommission vom 9. September 1997 über ein vorläufiges Versuchsprogramm für Diagnose, Nachweis und Identifizierung von Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith in Kartoffeln

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Virulenz der als Pseudomonas solanacearum identifizierten Kulturen. Aus der Kultur und einem positiven Kontrollstamm ein Inokulum mit einer Zelldichte von 106/ml zubereiten. 5-10 Tomatenpflanzen oder Eierfrüchte vorzugsweise im Dreiblattstadium oder älter beimpfen (Abschnitt III. 6). Bis zu zwei Wochen bei Temperaturen von 22 °C-28 °C und hoher relativer Luftfeuchtigkeit kultivieren und täglich wässern. Auf Anzeichen von Welke und/oder Epinastie, Chlorosen, Stauchungen achten. Von Pflanzen mit charakteristischen Symptomen wie folgt isolieren: - ein Stengelstück 2 cm oberhalb der Inokulationsstelle entnehmen; - in wenig sterilem destilliertem Wasser oder 50mM Phosphatpuffer suspendieren, zerkleinern und ausplattieren, inkubieren, anschließend auf typische Kolonien von Pseudomonas solanacearum bonitieren. ABSCHNITT III NACHWEIS UND IDENTIFIZIERUNG VON PSEUDOMONAS SOLANACEARUM IN PROBEN VON KARTOFFELKNOLLEN Hinweis: Die Standardprobengröße besteht aus 200 Knollen. Das Verfahren ist aber auch für Proben mit weniger als 200 Knollen geeignet. 1. Vorbereitung der Probe für den Test Hinweis: Das mit diesem Verfahren gewonnene Kartoffelextraktpellet kann auch für den Nachweis von Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus verwendet werden. Optionen vor dem Test, falls als zweckmäßig angesehen: i) Die Probe bis zu 2 Wochen bei 25-30 °C inkubieren, um die Vermehrung geringer Pseudomonas-solanacearum-Populationen zu fördern; ii) die Knollen unter fließendem Wasser mit geeigneten Desinfektions- und Waschmitteln waschen. Die Knollen an der Luft trocknen. 1.1. Mit einem sauberen und desinfizierten Skalpell oder Gemüsemesser die Schale am Nabelende der Knolle entfernen, so daß das vaskuläre Gewebe sichtbar wird. Am Nabelende jeder Knolle sorgfältig ein kleines kegelförmiges Stück (3-5 mm Durchmesser) vaskulären Gewebes herausschneiden. Dabei ist darauf zu achten, daß möglichst wenig nichtvaskuläres Gewebe erfaßt wird. An jeder Knolle der Probe durchführen. Hinweis: In dieser Phase können die Knollen visuell untersucht werden (Abschnitt II.1). Knollen mit Symptomen oder starker Fäule sind auszusondern und gesondert zu prüfen (Abschnitt II). 1.2. Die Nabelenden in einen geschlossenen Behälter geben. Die Nabelenden sollten sofort verarbeitet werden. Ist dies nicht möglich, sollten sie nicht länger als 24 Stunden oder bei 4 °C nicht länger als 72 Stunden aufbewahrt werden. 1.3. Die Nabelenden sind nach einem der folgenden Verfahren zu verarbeiten: i) Die Nabelenden in einen geeigneten Behälter geben. Ausreichendes Volumen Mazerationspuffer (Anlage 2) zugeben, um die Nabelenden zu bedecken. Die Stücke in einem Waring-Blender oder Ultra-Turrax gerade bis zur vollständigen Homogenisierung zerkleinern. Eine zu starke Homogenisierung sollte vermieden werden. Das Mazerat 15-30 Minuten ziehen lassen. ii) Die Nabelenden in einen geeigneten Behälter geben. Ausreichendes Volumen Mazerationspuffer zugeben, um die Nabelenden zu bedecken. Den Behälter auf eine Schüttelmaschine stellen. Bei 50-100 rpm 4 Stunden bei 20 °C-22 °C oder 16-24 Stunden bei 4 °C inkubieren. iii) Die Nabelenden in einen festen Einmalmazerationsbeutel (z. B. Stomacher-Beutel, Abmessungen 105 mm × 150 mm, strahlungssteril) geben. Die Nabelenden mit einem geeigneten Werkzeug, z. B. einem Hammer, bis zur vollständigen Homogenisierung zerkleinern. Ausreichendes Volumen des Mazerationspuffers zugeben, um die Nabelenden zu bedecken. Das Mazerat 15-30 Minuten absetzen lassen. 1.4. Die Bakterien sind nach einem der folgenden Verfahren aus den aufgearbeiteten Nabelenden zu extrahieren: i) Das Mazerat vorsichtig in Zentrifugenröhrchen abgießen, Rückstand dabei im Behälter oder Beutel lassen. Wenn das dekantierte Mazerat trüb ist: bei einer Temperatur unter 10 °C und nicht mehr als 180 g 10 Minuten zentrifugieren. Dekantiertes Mazerat oder Überstand von der ersten Zentrifugierung 15 Minuten lang bei 7 000 g oder 10 Minuten lang bei 10 000 g und bei einer Temperatur unter 10 °C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen, ohne das Pellet aufzurühren. ii) Das Mazerat durch ein Filtrationssystem mit einer Porenweite von 40-100 µm filtrieren. Dabei ist die Filtration mit einer Vakuumpumpe zu verstärken. Das Filtrat in einem Zentrifugenröhrchen auffangen. Das Filtrat mit Mazerationspuffer waschen. Das Filtrat 15 Minuten lang bei 7 000 g oder 10 Minuten lang bei 10 000 g und bei einer Temperatur unter 10 °C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen, ohne das Pellet aufzurühren. 1.5. Das Pellet in 1 ml Pelletpuffer (Anlage 2) suspendieren. In zwei gleiche Teile und jeden Teil in ein Mikroröhrchen fuellen. Ein Mikroröhrchen wird für den Test verwendet. Der Rest dieses Extrakts wird während des Tests bei 4 °C aufbewahrt. Dem anderen Mikroröhrchen 10-25 % (v/v) steriles Glycerin zugeben. Vortexen. Bei - 18 °C (Wochen) oder - 70 °C (Monate) lagern. 2. IF-Test Antiserum für Pseudomonas solanacearum, vorzugsweise Rasse 3/Biovar 2, verwenden. Den Titer an einer Suspension von 106 Zellen je ml eines homologen Stammes von Pseudomonas solanacearum mit einer geeigneten Verdünnung des Fluoreszeinisothiocyanat-Konjugats (FITC) nach den Empfehlungen des Herstellers bestimmen. Das Rohserum sollte einen IF-Titer von mindestens 1 : 2 000 haben. Multiwell-Objektträger vorzugsweise mit 10 Feldern von mindestens 6 mm Durchmesser verwenden. Auf jeden Objektträger eine FITC-Konjugatkontrolle auftragen. Bei einer großen Anzahl von Objektträgern kann auf die PBS-Kontrolle verzichtet werden. Der Test sollte allerdings mit einer PBS-Kontrolle wiederholt werden, wenn die FITC-Kontrolle eine positive Zelle aufweist. Separate Positivkontroll-Träger mit einer Suspension von 106 Zellen je ml von einem Stamm der entsprechenden Rasse/Biovar von Pseudomonas solanacearum vorbereiten. In jeder Testreihe ist ein Objektträger zu verwenden. 2.1. Die Objektträger sind nach einem der folgenden Verfahren vorzubereiten: i) Pellets mit relativ wenig Stärke: Ein abgemessenes Standardvolumen (15 µl reichen für ein Feld von 6 mm Durchmesser aus - bei größeren Feldern ein entsprechend größeres Volumen verwenden) des resuspendierten Pellets auf eine Reihe von Feldern pipettieren. Die verbleibende Reihe kann wie in Abbildung 1 dargestellt für ein Duplikat oder für eine zweite Probe verwendet werden. ii) Andere Pellets: Dezimalverdünnungen, d. h. >NUM>1/>DEN>10, >NUM>1/>DEN>100 und >NUM>1/>DEN>1 000, des resuspendierten Pellets in Pelletpuffer herstellen. Ein abgeschlossenes Standardvolumen (15 µl reichen für ein Feld von 6 mm Durchmesser aus - bei größeren Feldern ein entsprechendes größeres Volumen verwenden) des resuspendierten Pellets und jeder Verdünnung auf eine Reihe von Feldern pipettieren. Die verbleibende Reihe kann wie in Abbildung 2 dargestellt für ein Duplikat oder für eine zweite Probe verwendet werden. 2.2. Tropfen trocknen lassen. Bakterienzellen entweder durch Erhitzen, Abflammen oder mit 95 %igem Ethanol am Objektträger fixieren. 2.3. IF-Verfahren i) Bei Objektträgervorbereitung nach 2.1.i): Einen Satz Zweifachverdünnungen des Antiserums in IF-Puffer (Anlage 3) zubereiten: ¼ des Titers (>NUM>T/>DEN>4), ½ des Titers (>NUM>T/>DEN>2), Titer (T) und das Doppelte des Titers (2T). ii) Bei Objektträgervorbereitung nach 2.1.ii): Zubereitung der Arbeitsverdünnung des Antiserums in IF-Puffer. Die Arbeitsverdünnung ist die Verdünnung des Antiserums mit optimaler Spezifität und hat normalerweise die Hälfte des Titers. >PLATZ FÜR EINE TABELLE> >PLATZ FÜR EINE TABELLE> 2.3.1. Die Objektträger auf feuchten Papiertüchern auslegen. Alle Testfelder mit Antiserumverdünnung(en) bedecken. Auf die FITC-Fehler PBS auftragen. Das auf die Felder aufgetragene Antiserumvolumen muß dem Volumen des aufgetragenen Extraktes entsprechen. 2.3.2. Abgedeckt 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. 2.3.3. Die Antiserumtropfen vom Objektträger vorsichtig abschütteln, und die Objektträger sorgfältig mit IF-Puffer spülen. 5 Minuten mit IF-Puffer-Tween und anschließend 5 Minuten in IF-Puffer waschen (Anlage 3). Überschüssige Feuchtigkeit sorgfältig entfernen. 2.3.4. Die Objektträger auf feuchten Papiertüchern auslegen. Die Testfelder und das FITC-Feld mit der Verdünnung des zur Bestimmung des Titers verwendeten FITC-Konjugats bedecken. Das auf die Felder aufgetragene Konjugatvolumen muß dem Volumen des aufgetragenen Antiserums entsprechen. 2.3.5. Abgedeckt 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. 2.3.6. Die Konjugattropfen vorsichtig vom Objektträger abschütteln. Wie unter 2.3.3 angegeben waschen und spülen. Überschüssige Feuchtigkeit sorgfältig entfernen. 2.3.7. Auf jedes Feld 5-10 µl 0,1 M phosphatgepuffertes Glycerin (Anlage 3) oder eine ähnliche Deckfluessigkeit auftragen und Deckglas auflegen. 2.4. Auswertung des IF-Tests Objektträger unter einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit Filtern, die für FITC-Anregung geeignet sind, unter Ölimmersion bei einer Vergrößerung von 500-1 000 untersuchen. Jedes Feld in zwei rechtwinklig zueinanderstehenden Durchmessern sowie entlang des Feldrandes mikroskopisch untersuchen. Zunächst den Objektträger mit der Positivkontrolle prüfen. Die Zellen müssen stark fluoreszieren und vollständig gefärbt sein. Hinweis: Bei abweichender Färbung zum Normalzustand ist der Test zu wiederholen. Auswertung der zu untersuchenden Objektträger. Zunächst auf Abwesenheit von fluoreszierenden Zellen in den FITC-Kontrollfeldern prüfen. Fluoreszierende Zellen im FITC-Kontrollfeld deuten auf unspezifische Bindung des Konjugats, Autofluoreszenz oder Kontamination hin. Hinweis: Wenn dies festgestellt wird, ist der Test zu wiederholen. Stark fluoreszierende Zellen mit charakteristischer Morphologie von Pseudomonas solanacearum in den Testfeldern beobachten. Die Intensität der Fluoreszenz muß der des positiven Kontrollstammes bei gleicher Antiserumverdünnung entsprechen. Zellen mit unvollständiger Färbung oder mit schwacher Fluoreszenz sind nicht zu berücksichtigen, es sei denn, es gibt viele solcher Zellen (siehe Auswertung des IF-Testergebnisses). Auswertung des IF-Testergebnisses i) Für jede Probe, bei der keine stark fluoreszierenden Zellen mit charakteristischer Morphologie gefunden werden, ist der IF-Test negativ. ii) Für jede Probe, bei der stark fluoreszierende Zellen mit charakteristischer Morphologie gefunden werden, ist die mittlere Anzahl der Zellen pro Mikroskopfeld zu bestimmen und je ml (N) resuspendiertes Pellet (Anlage 4) zu berechnen. Eine Bakteriendichte von ungefähr 10³ Zellen je ml resuspendiertes Pellet ist als die Nachweisgrenze für den IF-Test anzusehen: - Bei Proben mit N > 10³ Zellen je ml resuspendiertes Pellet ist der IF-Test als positiv zu bewerten; - bei Proben mit N > 10³ Zellen je ml resuspendiertes Pellet kann der IF-Test als positiv bewertet werden; iii) Wird eine große Anzahl (< 105 Zellen je ml) unvollständig oder schwach fluoreszierender Zellen beim Antiserumtiter festgestellt, sollte ein zweiter Test durchgeführt werden: - entweder ein Test auf der Grundlage eines anderen biologischen Prinzips oder - ein weiterer IF-Test, entweder mit einem zweiten Antiserum oder einer zehnfachen Verdünnung des Pellets. 3. ELISA-Test (Nach Robinson-Smith et al., 1995) Antiserum für Pseudomonas solanacearum, vorzugsweise Rasse 3 Biovar 2, verwenden. Den Titer an einer Suspension von 106 Zellen je ml eines homologen Stamms von Pseudomonas solanacearum bestimmen. Es wird empfohlen, NUNC-Polysorb-Mikrotiterplatten zu verwenden. Der Test sollte eine negative Kartoffelextraktkontrolle und eine PBS-Kontrolle umfassen. Als positive Kontrolle ist eine Suspension von > 106 Zellen je ml von einem Stamm der entsprechenden Rasse/Biovar von Pseudomonas solanacearum zu verwenden. Der Test ist genauso durchzuführen wie für die Probe(n), aber getrennt von den Proben auf der Mikrotiterplatte. 3.1. 100-200 µl des resuspendierten Pellets in ein Mikroröhrchen pipettieren. 4 Minuten lang bei 100 °C erhitzen. Mikroröhrchen auf Eis legen. 3.2. Gleiches Volumen doppelt starken Carbonat-Beschichtungs-Puffer (Anlage 5) zugeben. Vortexen. 3.3. In mindestens zwei Vertiefungen der Mikrotiterplatte Aliquote von jeweils 100 µl geben. Eine Stunde bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C inkubieren. 3.4. Extrakte aus den Vertiefungen vollständig entfernen. Vertiefungen dreimal mit PBS-Tween (Anlage 5) waschen; die letzte Waschlösung sollte mindestens 5 Minuten in den Vertiefungen bleiben. 3.5. Die geeignete Verdünnung vom Pseudomonas-solanacearum-Antiserum in Blockierungs-Puffer (Anlage 5) zubereiten. 100 µl der Antiserumverdünnung in die Vertiefungen geben. Eine Stunde bei 37 °C inkubieren. 3.6. Antiserum aus den Vertiefungen vollständig entfernen. Vertiefungen wie zuvor beschrieben (3.4) waschen. 3.7. Die geeignete Verdünnung des Konjugats der alkalischen Phosphatase in Blockierungs-Puffer zubereiten. 100 µl der Konjugatverdünnung in die Vertiefungen geben. Eine Stunde bei 37 °C inkubieren. 3.8. Konjugat aus den Vertiefungen vollständig entfernen. Vertiefungen wie zuvor beschrieben (3.4 und 3.6) waschen. 3.9. Alkalische Phosphatasesubstratlösung zubereiten (Anlage 5). 100 µl in die Vertiefungen geben. Zwischen 30 Minuten und 1 Stunde bei Dunkelheit und Raumtemperatur inkubieren. 3.10. Extinktion bei 409 nm ablesen. Auswertung des ELISA-Tests Der ELISA-Test ist negativ, wenn die optische Dichte (OD) der Probe < 2 × OD der negativen Kontrolle beträgt. Der ELISA-Test ist positiv, wenn die optische Dichte (OD) der Probe > 2 × OD der negativen Kontrolle beträgt. 4. PCR-Test (nach Seal et al., 1993) Hinweis: Bei allen Schritten der Probenzubereitung und anderen Tätigkeiten in Zusammenhang mit PCR müssen Pipettenspitzen mit Filtern verwendet werden. Eine Suspension von 106 Zellen je ml von einem Rasse-3-Biovar-2-Stamm von Pseudomonas solanacearum als positive Kontrolle zubereiten. Der Test ist genauso durchzuführen wie für die Probe(n). 4.1. 100 µl des resuspendierten Pellets in ein Mikroröhrchen pipettieren. Alternativ können 90 µl des resuspendierten Pellets in ein Mikroröhrchen gegeben werden, das 10 µl 0,5 M NaOH enthält. Durch wiederholtes Umdrehen des Mikroröhrchens mischen. 4.2. 4 Minuten bei 100 °C erhitzen. Mikroampulle sofort auf Eis legen. 4.3. Zumindest zwei Dezimalverdünnungen, z. B. >NUM>1/>DEN>10 und >NUM>1/>DEN>100, oder bei Bedarf mehr, in sterilem, destilliertem oder ultrareinem Wasser (UPW) zubereiten. 4.4. Die PCR-Reaktionsmischung (Anlage 6) in einem sterilen Röhrchen durch Zugabe der folgenden Komponenten in folgender Reihenfolge zubereiten: >PLATZ FÜR EINE TABELLE> Für mehr Reaktionen Die Menge jeder Komponente für die erforderliche Anzahl von Reaktionen berechnen. Die Komponenten mischen und 45 µl-48 µl des Gemisches in sterile PCR-Röhrchen geben. Röhrchen mit der PCR-Reaktionsmischung auf Eis lagern. Für Reaktionsvolumen von 25 µl: Menge der Komponenten entsprechend verringern. 4.5. PCR-Amplifikation 4.5.1. Fakultativ! Röhrchen mit der gekochten Probe und der positiven Kontrolle pulszentrifugieren. Den Röhrchen mit der PCR-Reaktionsmischung in der angegebenen Reihenfolge 2-5 µl der Probe(n), Wasserkontrolle und positiven Kontrolle zugeben. Röhrchen in den Heizblock des DNA-Thermocyclers stellen. 4.5.2. Folgendes Programm durchführen: 1 Zyklus: i) 2 Minuten bei 96 °C: Denaturierung der Matrizze; 50 Zyklen: ii) 20 Sekunden bei 94 °C: Denaturierung; iii) 20 Sekunden bei 68 °C: Anlagerung der Primer; iv) 30 Sekunden bei 72 °C: Verlängerung der Kopie; 1 Zyklus: v) 10 Minuten bei 72 °C: weitere Verlängerung; 1 Zyklus: vi) bei 4 °C halten. Hinweis: Diese Parameter beziehen sich auf einen Perkin Elmer 9600. Bei anderen Thermocyclern ist möglicherweise eine Mineralölschicht im PCR-Reaktionsröhrchen erforderlich und/oder eine Veränderung der Dauer von Schritt ii), iii) und iv) im Amplifikationsprofil. 4.5.3. Röhrchen aus dem Thermocycler nehmen. Das PCR-Produkt analysieren. Wenn dies nicht sofort geschehen kann, sind die Röhrchen zur Verwendung am selben Tag bei 4 °C bzw. für einen längeren Zeitraum bei -18 °C zu lagern. 4.6. Analyse des PCR-Produkts Die PCR-Fragmente werden durch Agarose-Gelelektrophorese und Anfärben mit Ethidiumbromid nachgewiesen. 4.6.1. Ein geeignetes Agarosegel zubereiten, indem man Agarose in Tris/Acetat-Elektrophorese-Puffer (TAE) vorsichtig aufkocht. 4.6.2. Die geschmolzene Agarose auf 50-60 °C abkühlen, in die Gelgießkammer der Elektrophoreseapparatur fuellen und den Kamm einsetzen. Die Lösung erstarren lassen. 4.6.3. Den Kamm herausnehmen. Das Gel in TAE tauchen, so daß es gerade 2-3 mm mit dem Puffer bedeckt ist. 4.6.4. 3-µl-Tropfen Beladungs-Puffer auf Parafilm geben. 12 µl des PCR-Produkts von den Proben, der Positivkontrolle oder der Wasserkontrolle zugeben und durch leichtes Ansaugen in der Pipettenspitze vor dem Einfuellen mischen. Die angegebenen Volumina können der Kapazität der Vertiefungen im Agarosegel angepaßt werden. 4.6.5. Die Vertiefungen des Gels sorgfältig befuellen. In mindestens eine Vertiefung als Bezugssubstanz einen geeigneten DNA-Marker geben. 4.6.6. Netzgerät an die Elektrophoreseapparatur anschließen. Die Elektrophorese bei 5-8 V/cm durchführen, bis die Front des Trackingindikators sich innerhalb von 1 cm vom Ende des Gels befindet. 4.6.7. Stromversorgung abschalten und Netzgerät von der Elektrophoreseapparatur abnehmen. Das Gel vorsichtig herausnehmen und 30-45 Minuten in Ethidiumbromidlösung tränken. Hinweis: Beim Umgang mit Ethidiumbromid, einem starken Mutagen, sind stets Einmalhandschuhe zu tragen! 4.6.8. Färbemittel 10-15 Minuten in destilliertem Wasser abwaschen. 4.6.9. Das/die amplifizierte(n) DNA-Fragment(e) durch UV-Transillumination sichtbar machen. Das PCR-Produkt von Pseudomonas solanacearum mit den Primern OLI-1 und Y-2 hat eine Länge von 288 bp. Mit dem DNA-Marker und der positiven Kontrolle vergleichen. Hinweis: Die Wasserkontrolle muß auf jeden Fall negativ sein. Fällt sie positiv aus, ist der Test zu wiederholen. 4.6.10. Zur Dokumentation gegebenenfalls das Gel photographieren. 4.6.11. Die Echtheit des amplifizierten Fragments durch Restriktionsenzymanalyse (REA) bestätigen. 4.7. Restriktionsenzymanalyse (REA) 4.7.1. 8,5 µl des PCR-Produkts (4.5.3) in ein neues Mikroröhrchen geben. 1 µl des 10 × Enzympuffers und 0,5 µl des Restriktionsenzyms Avall zugeben. 4.7.2. Durch leichtes Ansaugen in der Pipettenspitze mischen. Wenn Tropfen an den Wänden des Röhrchens verbleiben, in der Mikrozentrifuge pulszentrifugieren. Eine Stunde bei 37 °C inkubieren. 4.7.3. Das verdaute PCR-Fragment wie zuvor (4.6) durch Agarose-Gelelektrophorese analysieren. Auswertung des PCR-Testergebnisses Der PCR-Test ist negativ, wenn das charakteristische 288-bp-Fragment nicht nachgewiesen und das Fragment für den positiven Kontrollstamm von Pseudomonas solanacearum nachgewiesen wird. Der PCR-Test ist positiv, wenn das 288-bp-Fragment nachgewiesen wird und die REA zeigt, daß das amplifizierte Fragment mit dem positiven Kontrollstamm von Pseudomonas solanacearum identisch ist. 5. Selektivausstrichtest (nach Elphinstone et al., 1996) 5.1. Der Test wird mit einer geeigneten Verdünnungsausstrichtechnik durchgeführt, z. B.: i) mindestens zwei Dezimalverdünnungen, d. h. >NUM>1/>DEN>10 und >NUM>1/>DEN>100, des resuspendierten Pellets in Pelletpuffer zubereiten. Ein abgemessenes Standardvolumen (50-100 µl) des resuspendierten Pellets und jeder Verdünnung auf ein modifiziertes selektives SMSA-Medium (Anlage 7) aufbringen und mit einem Glasstäbchen über die gesamte Fläche des Mediums verteilen. Wenn es zweckmäßig erscheint, ist mit einer 10-µl-Öse auch ein Verdünnungsausstrich des resuspendierten Pellets durchzuführen. Die Öse zwischen den Strichen abflammen. ii) Ein abgemessenes Standardvolumen (50-100 µl) des resuspendierten Pellets auf ein modifiziertes selektives SMSA-Medium aufbringen und mit einem Glasstäbchen über die gesamte Fläche des Mediums verteilen. Das Stäbchen ohne Abflammen auf zwei weiteren Platten mit modifiziertem SMSA-Medium ausstreichen. 5.2. Mit der gleichen Verdünnungsausstrichtechnik eine Suspension von 106 Zellen je ml von einem virulenten Rasse-3-/Biovar-2-Stamm von Pseudomonas solanacearum als positive Kontrolle auf einen Satz separater Platten mit modifiziertem SMSA-Medium auftragen. 5.3. Die Platten bei 28 °C bebrüten. Die Platten nach 3 Tagen erstmals prüfen. Bei Negativbefund bis zu insgesamt 6 Tagen weiter bebrüten. Virulente Isolate von Pseudomonas solanacearum bilden milchig weiße, flache, unregelmäßige und fluessige Kolonien mit deutlich erkennbaren roten bis purpurfarbenen Zentren mit Strichen oder Wirbeln. 5.4. Kolonien mit charakteristischer Morphologie durch Subkultur auf einem Universalnährmedium (Anlage 1) reinigen. 5.5. Reinkulturen identifizieren (Abschnitt II.4.1) und positive Pseudomonas-solanacearum-Kulturen durch einen Pathogenitätstest (Abschnitt II.4.3) bestätigen. Auswertung des Ergebnisses des Selektivausstrichtests Der Selektivausstrichtest ist negativ, wenn nach sechs Tagen keine Kolonien isoliert werden oder wenn keine charakteristischen Kolonien von Pseudomonas solanacearum isoliert werden, vorausgesetzt, daß keine Hemmung durch Kolonien anderer Bakterien vermutet wird und daß charakteristische Kolonien von Pseudomonas solanacearum von den positiven Kontrollen gefunden worden sind. Der Verdünnungsausstrichtest ist positiv, wenn charakteristische Kolonien von Pseudomonas solanacearum isoliert werden. 6. Bioassay-Test (nach Janse, 1988) 6.1. Für jede Probe sind 10 Testpflanzen anfälliger Tomaten- oder Eierfruchtsämlinge im Dreiblattstadium zu verwenden. Die Testpflanzen sind 24 Stunden vor der Inokulation nicht zu wässern. 6.2. 100 µl des resuspendierten Pellets auf die Testpflanzen aufteilen. Den Stengel zwischen den Keimblättern sowie eine oder mehrere weitere Stellen beimpfen. 6.3. Mit der gleichen Technik 10 Sämlinge mit einer Suspension von 106 Zellen je ml eines virulenten Rasse-3-/Biovar-2-Stamms von Pseudomonas solanacearum als positive Kontrolle und mit Pelletpuffer als negative Kontrolle beimpfen. Zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen sind die positiven Kontrollpflanzen von den anderen Pflanzen zu trennen. 6.4. Die Testpflanzen bei 22 °C bis 28 °C und hoher relativer Luftfeuchte bis zu 4 Wochen und täglichem Wässern weiter wachsen lassen. Auf Anzeichen von Welke, Epinastie, Chlorosen und/oder Wachstumsstörungen achten. 6.5. Von infizierten Pflanzen isolieren (Abschnitt II). Reinkulturen mit charakteristischer Morphologie identifizieren (Abschnitt II.4.1) und Pseudomonas-solanacearum-Kulturen durch einen Pathogenitätstest bestätigen (Abschnitt II.4.3). 6.6. Bei Bedarf bei Testpflanzen, die keine Anzeichen für eine Infektion zeigen, überprüfen, ob keine Infektion vorliegt. Von jeder Testpflanze 2 cm über der Inokulationsstelle einen 1 cm großen Abschnitt des Stengels entnehmen. Die Gewebeteile in Mazerationspuffer homogenisieren. Verdünnungsausstrichtest durchführen (Abschnitt III.5.1). Bei positivem Befund Reinkulturen mit charakteristischer Morphologie identifizieren (Abschnitt II.4.1) und positive Kulturen durch einen Pathogenitätstest (Abschnitt II.4.3) bestätigen. Auswertung des Bioassay-Testergebnisses Der Bioassay-Test ist negativ, wenn die Testpflanzen nicht mit Pseudomonas solanacearum infiziert sind, vorausgesetzt, Pseudomonas solanacearum ist in den Positivkontrollen nachgewiesen worden. Der Bioassay-Test ist positiv, wenn die Testpflanzen mit Pseudomonas solanacearum infiziert sind. 7. Anreicherungstest (nach J. G. Elphinstone et al., 1996) 7.1. 100 µl des resuspendierten Pellets in 3 ml modifizierte SMSA-Bouillon geben (Anlage 7). 7.2. 48 Stunden lang, auf keinen Fall länger als 72 Stunden, bei 28 °C mit zwecks Belüftung lose aufgesetzter Kappe bebrüten. 7.3. Kappe schließen und vortexen. Für den IF-Test (dieser Abschnitt, Ziffer 2), den ELISA-Test (