97/647/EG: Entscheidung der Kommission vom 9. September 1997 über ein vorläufiges Versuchsprogramm für Diagnose, Nachweis und Identifizierung von Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith in Kartoffeln

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dieser Abschnitt, Ziffer 3) und/oder den PCR-Test (dieser Abschnitt, Ziffer 4) aliquotieren. 8. Pathogenitätstest Siehe Abschnitt II.4.3. Anlage 1 Nährmedien für Kulturen von Pseudomonas solanacearum Nähragar (NA) >PLATZ FÜR EINE TABELLE> In 1-Liter-Kolben 0,5-Liter-Volumen des Mediums zubereiten. Die Substanzen auflösen. Durch 15minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren. Auf 50 °C abkühlen. Platten gießen. Hefe-Pepton-Glukose-Agar (YPGA) >PLATZ FÜR EINE TABELLE> In 1-Liter-Kolben 0,5-Liter-Volumen des Mediums zubereiten. Die Substanzen auflösen. Durch 15minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren. Auf 50 °C abkühlen. Platten gießen. Saccharose-Pepton-Agar (SPA) >PLATZ FÜR EINE TABELLE> In 1-Liter-Kolben 0,5-Liter-Volumen des Mediums zubereiten. Die Substanzen auflösen. Erforderlichenfalls auf pH 7,2-7,4 einstellen. Durch 15minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren. Auf 50 °C abkühlen. Platten gießen. Kelmans Tetrazolium-Medium >PLATZ FÜR EINE TABELLE> In 1-Liter-Kolben 0,5-Liter-Volumen des Mediums zubereiten. Die Substanzen auflösen. Durch 15minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren. Auf 50 °C abkühlen. Filtersterilisierte wäßrige Lösung von Triphenyl-Tetrazoliumchlorid (Sigma) bis zu einer Endkonzentration von 50 mg/l zugeben. Platten gießen. Anlage 2 Material für die Vorbereitung der Probe Mazerationspuffer: 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0 Dieser Puffer wird für die Gewebemazeration verwendet. >PLATZ FÜR EINE TABELLE> Die Substanzen auflösen und den pH-Wert bestimmen. Nach Bedarf aliquotieren. Durch 15minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren. Bei Durchführung der direkten PCR wird die Zugabe von 5 % Polyvinylpyrrolidon MG 40.000 (PVP-40) empfohlen, um die Inzidenz der Amplifizierungshemmung durch aromatische Moleküle im Extrakt zu reduzieren. Bei Anwendung des Waring-Blender- oder Ultra-Turrax-Homogenisierungsverfahrens zur Mazeration des Kartoffelgewebes wird die Zugabe eines Verfluessigungsmittels, eines Schaumverhütungsmittels oder eines Antioxidationsmittels empfohlen. >PLATZ FÜR EINE TABELLE> Getrennt autoklavieren. Bis zum Erreichen der gewünschten Konzentration zugeben. Pelletpuffer: 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,2 Dieser Puffer wird für die Resuspendierung und Verdünnung der Pellets der Kartoffelnabelenden verwendet. >PLATZ FÜR EINE TABELLE> Die Substanzen auflösen und den pH-Wert prüfen. Nach Bedarf aliquotieren. Durch 15minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren. Anlage 3 Material für den IF-Test IF-Puffer: 10 mM phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2 Dieser Puffer wird für die Verdünnung von Antisera benutzt. >PLATZ FÜR EINE TABELLE> Die Substanzen auflösen und den pH-Wert prüfen. Nach Bedarf aliquotieren. Durch 15minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren. IF-Puffer-Tween Dieser Puffer wird zum Waschen von Objektträgern verwendet. 0,1 % Tween 20 zum IF-Puffer geben. 0,1 M phosphatgepuffertes Glycerin, pH 7,6 Dieser Puffer wird zur Erhöhung der Fluoreszenz als Einbettungsmittel auf den Feldern des IF-Objektträgers verwendet. >PLATZ FÜR EINE TABELLE> Anlage 4 Bestimmung des Kontaminationsgrads im IF-Test Fläche (S) eines Feldes eines Multiwell-Objektträgers = >NUM>ð D²>DEN>4 >PLATZ FÜR EINE TABELLE> (1) Fläche (s) des Objektivfeldes = >NUM>ð d²>DEN>4 >PLATZ FÜR EINE TABELLE> (2) d entweder durch direktes Messen oder aufgrund der folgenden Formeln ermitteln: s = >NUM>ð i²>DEN>G² K² × 4 (3) >PLATZ FÜR EINE TABELLE> Von (2) d = √>NUM>4 s>DEN>ð (4) Von (3) d = √>NUM>4 × >NUM>ð i²>DEN>G² K² × 4>DEN>ð = NUM>i>DEN>GK Anzahl der typischen fluoreszierenden Zellen je Feld (c) zählen. Anzahl der typischen fluoreszierenden Zellen je Gesamtfeld (C) berechnen. C = c >NUM>S>DEN>s Anzahl der typischen fluoreszierenden Zellen je ml Pellet (N) berechnen. N = C × >NUM>1 000>DEN>y × F >PLATZ FÜR EINE TABELLE> Anlage 5 Material für den ELISA-Test 2 × Carbonat-Beschichtungs-Puffer, pH 9,6 >PLATZ FÜR EINE TABELLE> Die Substanzen auflösen und den pH-Wert messen. Nach Bedarf aliquotieren. Durch 15minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren. Wenn der Extrakt einen hohen Anteil aromatischer Moleküle enthält, kann Natriumsulfit mit einer Endkonzentration von 0,2 % als Antioxidationsmittel zugegeben werden. 10 × phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 >PLATZ FÜR EINE TABELLE> Die Substanzen auflösen und den pH-Wert messen. Nach Bedarf aliquotieren. Durch 15minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung-Tween (PBS-T) >PLATZ FÜR EINE TABELLE> (Antikörper)-Blockierungs-Puffer (muß frisch angesetzt werden) >PLATZ FÜR EINE TABELLE> Alkalische Phosphatase-Substratlösung, pH 9,8 >PLATZ FÜR EINE TABELLE> Mischen und mit konzentrierter HCl auf pH 9,8 einstellen. Mit destilliertem Wasser auf 1 Liter auffuellen. 0,2 g MgCl2 zugeben. Je 15 ml Lösung 2 Phosphatase-Substrattabletten (5 mg) (Sigma) auflösen. Anlage 6 Material für den PCR-Test Sequenz der Oligonukleotidprimer >PLATZ FÜR EINE TABELLE> Reagenzien siehe Seal et al., 1993. Anlage 7 Material für den Selektivausstrich- und Anreicherungstest SMSA-Selektivmedium (Engelbrecht, 1994, modifiziert von Elphinstone et al., 1996) Basismedium >PLATZ FÜR EINE TABELLE> In 1-Liter-Kolben 0,5-Liter-Volumen des Mediums zubereiten. Die Inhaltsstoffe auflösen und den pH-Wert prüfen. Erforderlichenfalls vor dem Autoklavieren auf pH 6,5 einstellen. Pseudomonas solanacearum wächst auf dem Medium bei pH > 7,0 nicht gut. Durch 15minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren. Auf 50 °C abkühlen. Für die angegebenen Endkonzentrationen folgende Inhaltsstoffe (alle von Sigma) zugeben: >PLATZ FÜR EINE TABELLE> Die Inhaltsstoffe in 70%igem Ethanol zu den für das zubereitete Mediumvolumen angegebenen Konzentrationen auflösen. einige Inhaltsstoffe, z. B. Polymixin und Chloramphenicol, müssen leicht erwärmt und geschüttelt werden. SMSA-BOUILLON (Elphinstone et al., 1996) Zubereitung wie für SMSA-Selektivmedium, jedoch ohne Agar. Aliquote von 3 ml in 30-ml-Einweg-Universalröhrchen fuellen. Bibliographie Buddenhagen, I.W.; Sequeira, L. and Kelman, A., 1962. Description of races in Pseudomonas solanacearum. Phytopathology 52, 726. Cook, D.; Elizabeth B. and Sequeira L., 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphism with DNA probes that specify virulence and hypersensitive respons. Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 113-121. Dinesen I.G. and DeBoer, S.H., 1995. 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