97/647/EG: Entscheidung der Kommission vom 9. September 1997 über ein vorläufiges Versuchsprogramm für Diagnose, Nachweis und Identifizierung von Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith in Kartoffeln

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Avis juridique important | 31997D0647 97/647/EG: Entscheidung der Kommission vom 9. September 1997 über ein vorläufiges Versuchsprogramm für Diagnose, Nachweis und Identifizierung von Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith in Kartoffeln Amtsblatt Nr. L 273 vom 06/10/1997 S. 0001 - 0025 ENTSCHEIDUNG DER KOMMISSION vom 9. September 1997 über ein vorläufiges Versuchsprogramm für Diagnose, Nachweis und Identifizierung von Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith in Kartoffeln (97/647/EG) DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN - gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft, gestützt auf die Richtlinie 77/93/EWG des Rates vom 21. Dezember 1976 über Maßnahmen zum Schutz der Gemeinschaft gegen die Einschleppung und Ausbreitung von Schadorganismen der Pflanzen und Pflanzenerzeugnisse (1), zuletzt geändert durch die Richtlinie 97/14/EG (2), insbesondere auf Artikel 15 Absatz 3, in Erwägung nachstehender Gründe: Gemäß der Entscheidung 95/506/EG der Kommission vom 24. November 1995 zur Ermächtigung bestimmter Mitgliedstaaten, vorübergehend zusätzliche Maßnahmen gegen die Verbreitung von Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith gegenüber dem Königreich der Niederlande zu treffen (3), geändert durch die Entscheidung 96/599/EG (4), insbesondere gemäß Artikel 1 Absatz 2 Buchstabe a) Buchstabe bb), müssen die Mitgliedstaaten bei der Durchführung amtlicher oder amtlich überwachter Tests an Kartoffeln das von der Pflanzenschutz-Organisation für Europa und den Mittelmeerraum (EPPO) (5) festgelegte Quarantäneverfahren Nr. 26 für Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith oder ein anderes nach dem Verfahren des Artikels 16a der Richtlinie 77/93/EWG genehmigtes Verfahren anwenden. Der Ad-hoc-Ausschuß der Sachverständigen für bakterielle Pflanzenkrankheiten, den die zuständigen Stellen der Europäischen Kommission unter der Schirmherrschaft des Ständigen Ausschusses für Pflanzenschutz eingesetzt haben, hat ein vorläufiges Versuchsprogramm ausgearbeitet, das den seit der Veröffentlichung des EPPO-Quarantäneverfahrens verbesserten Nachweis- und Versuchsverfahren Rechnung trägt. Dieses Versuchsprogramm ist insofern vorläufig, als insbesondere zur Sensitivität und Spezifität einzelner Tests weitere Forschungsarbeiten zu erwarten sind, um für die Aufnahme in eine aktualisierte Testmethode die optimalen verfügbaren Tests auswählen und standardisieren zu können. Das in dieser Entscheidung vorgesehene vorläufige Versuchsprogramm entspricht der Stellungnahme des Ständigen Ausschusses für Pflanzenschutz - HAT FOLGENDE ENTSCHEIDUNG ERLASSEN: Artikel 1 Das von der Pflanzenschutz-Organisation für Europa und den Mittelmeerraum (EPPO) festgelegte Quarantäneverfahren Nr. 26 für Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith wird zur Umsetzung von Artikel 1 Absatz 2 Buchstabe a) Buchstabe bb) der Entscheidung 95/506/EG, letztgültige Fassung, durch das im Anhang dieser Entscheidung beschriebene vorläufige Versuchsprogramm für Diagnose, Nachweis und Identifizierung von Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith ersetzt. Artikel 2 Diese Entscheidung ist an die Mitgliedstaaten gerichtet. Brüssel, den 9. September 1997 Für die Kommission Franz FISCHLER Mitglied der Kommission (1) ABl. L 26 vom 31. 1. 1977, S. 20. (2) ABl. L 87 vom 2. 4. 1997, S. 17. (3) ABl. L 291 vom 6. 12. 1995, S. 48. (4) ABl. L 265 vom 18. 10. 1996, S. 18. (5) EPPO/OEPP-Bulletin 20, S. 255-262 (1990). ANHANG VORLÄUFIGES TESTVERFAHREN ZUR DIAGNOSE, ZUM NACHWEIS UND ZUR IDENTIFIZIERUNG VON PSEUDOMONAS SOLANACEARUM (SMITH) SMITH ZWECK DES VERFAHRENS In der vorliegenden Beschreibung werden verschiedene Vorgangsweisen erläutert für i) die Diagnose der Schleimkrankheit an Kartoffelpflanzen und -knollen; ii) den Nachweis von Pseudomonas solanacearum an Proben von Kartoffelknollen; iii) die Identifizierung von Pseudomonas solanacearum. In den Anlagen werden die Aufbereitung des Versuchsmaterials, d. h. Nährmedien, Puffer, Lösungen, Reagenzien und Testpflanzen, sowie die Identifizierung und Charakterisierung von Pseudomonas solanacearum ausführlich erläutert. INHALT Abschnitt I. Anwendung des Verfahrens . 4 1. Diagnose der Schleimkrankheit an Kartoffelpflanzen und -knollen . 4 2. Nachweis und Identifizierung von Pseudomonas solanacearum in Proben von Kartoffelknollen . 6 Abschnitt II. Diagnose der Schleimkrankheit bei Kartoffelpflanzen und -knollen . 8 1. Symptome der Schleimkrankheit . 8 2. Schnell-Screeningtests . 8 3. Isolierungsverfahren . 9 4. Bestätigungstest(s) . 9 Abschnitt III. Nachweis und Identifizierung von Pseudomonas solanacearum in Proben von Kartoffelknollen . 12 1. Vorbereitung der Probe für den Test . 12 2. Immunfluoreszenztest (IF-Test) . 13 3. Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay (ELISA)-Test . 15 4. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCRTM)-Test . 15 5. Selektivausstrichtest . 17 6. Bioassay-Test . 18 7. Anreicherungstests . 18 8. Pathogenitätstest . 18 Anlage 1. Nährmedien für die Isolierung und Kultur von Pseudomonas solanacearum . 19 Anlage 2. Material für die Vorbereitung der Probe . 20 Anlage 3. Material für den IF-Test . 21 Anlage 4. Bestimmung des Kontaminationsgrades im IF-Test . 22 Anlage 5. Material für den ELISA-Test . 23 Anlage 6. Material für den PCR-Test . 24 Anlage 7. Material für den Selektivausstrichtest . 24 Bibliographie . 25 ABSCHNITT I ANWENDUNG DES TESTVERFAHRENS 1. Diagnose der Schleimkrankheit an Kartoffelpflanzen und -knollen Das Verfahren ist für Pflanzen und Knollen, die typische Symptome von Schleimkrankheit aufweisen oder bei denen aufgrund der Symptomatik der Verdacht einer Infektion mit Schleimkrankheit besteht, geeignet. Es umfaßt Schnell-Screeningtest(s), die Isolierung des Erregers aus infiziertem vaskulärem Gewebe auf Diagnosemedien und, bei positivem Befund, die Identifizierung der Kultur als Pseudomonas solanacearum. Fließdiagramm >VERWEIS AUF EIN SCHAUBILD> Anmerkungen zum Fließdiagramm >ANFANG EINES SCHAUBILD> (1) Beschreibung der Symptome in Abschnitt II.1. (2) Schnell-Screeningtest(s) erleichtern die vorläufige Diagnose. Geeignete Tests sind: Gefäßbündeltest (Abschnitt II.2), Prüfung auf Poly-ß-hydroxybutyratgranula (Abschnitt II.2), IF-Test (Abschnitt III.2), ELISA-Test (Abschnitt III.3), PCR-Test (Abschnitt III.4). (3) Obwohl die Isolierung des Erregers aus Pflanzenmaterial mit typischen Symptomen durch das Verdünnungsausstrichverfahren relativ einfach ist, kann das Anlegen von Kulturen in fortgeschrittenen Infektionsstadien scheitern. Saprophytische Bakterien, die auf erkranktem Gewebe wachsen, können den Erreger auf dem Isoliermedium überwachsen oder hemmen. Wenn der Isolierungstest negativ ausfällt, aber typische Krankheitssymptome vorliegen, ist die Isolierung zu wiederholen, vorzugsweise mit einem Selektivausstrichtest. (4) Eine Reinkultur von Pseudomonas solanacearum wird durch mindestens einen der in Abschnitt II.4.1 genannten Tests in Kombination mit einem Pathogenitätstest (Abschnitt II.4.3) zuverlässig identifiziert. Die Bestimmung von Biovar und Rasse ist fakultativ, wird aber für jeden neuen Fall empfohlen. >ENDE EINES SCHAUBILD> 2. Nachweis und Identifizierung von Pseudomonas solanacearum in Proben von Kartoffelknollen Das Verfahren ist zum Nachweis latenter Infektionen in Kartoffelknollen durch einen oder vorzugsweise mehrere Screeningtests geeignet, die bei positivem Befund durch die Isolierung des Erregers bestätigt werden. Im Fall der Isolierung typischer Kolonien erfolgt die Identifizierung einer Reinkultur als Pseudomonas solanacearum. Fließdiagramm >VERWEIS AUF EIN SCHAUBILD> Anmerkungen zum Fließdiagramm >ANFANG EINES SCHAUBILD> (1) Probengröße Die Standardprobengröße besteht aus 200 Knollen. Das Verfahren ist aber auch für Proben mit weniger als 200 Knollen geeignet. (2) Screeningtest(s) Ein einziger Test ist möglicherweise nicht sensitiv oder zuverlässig genug, um Pseudomonas solanacearum in einer Probe nachzuweisen. Daher wird empfohlen, mehrere Tests durchzuführen, die möglichst auf unterschiedlichen biologischen Prinzipien beruhen. (3) Immunfluoreszenztest Der IF-Test (indirekte Methode) ist ein bewährter Screeningtest. Das ist ein Vorteil gegenüber anderen Tests, die noch nicht vollständig ausgereift oder validiert sind. Der Test wird für viele andere Quarantäne-Bakterien, z. B. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, angewendet. Bei den für diese Methode angegebenen Parametern handelt es sich um einen sensitiven Test (Nachweisgrenze von 103-104 Zellen je ml Kartoffelextraktpellet). Ausschlaggebend für die Zuverlässigkeit des Testergebnisses ist die Qualität des Antiserums. Nur ein Antiserum mit einem hohen Titer (mindestens 2 000 für das Rohserum) ist akzeptabel, und alle Tests müssen bei dem Antiserumtiter oder einer Verdünnung unterhalb des Titers durchgeführt werden. Die indirekte Methode wird bevorzugt. Die direkte Methode kann angewandt werden, wenn Sensitivität und Spezifität des Tests denen der indirekten Methode gleichwertig sind. Der IF-Test bietet den Vorteil der subjektiven Auswertung der Zellmorphologie und der Fluoreszenzintensität, die Aufschluß über die Reaktionsspezifität geben. Kreuzreaktionen mit serologisch verwandten, aus dem Boden stammenden oder der Knolle anhaftenden Bakterien mit gleicher Zellmorphologie von Pseudomonas solanacearum sind häufig. Der IF-Test kann als einziger Screeningtest durchgeführt werden, doch wenn Kreuzreaktionen vermutet werden, sollte ein zweiter Test, der auf einem anderen biologischen Prinzip beruht, durchgeführt werden. In einem solchen Fall ist der Selektivausstrich am geeignetsten. (4) Selektivausstrich Mit dem bei diesem Verfahren verwendeten modifizierten SMSA-Medium und der Versuchsmethodik handelt es sich um einen sensitiven und selektiven Test für Pseudomonas solanacearum. Das Ergebnis liegt 3-6 Tage nach der Zubereitung der Probe vor. Der Erreger liegt direkt in einer Kultur vor und läßt sich leicht identifizieren. Wenn das Potential des Tests voll ausgeschöpft werden soll, müssen die Nabelenden sorgfältig vorbereitet werden, um Sekundärbakterien aus den Knollen auszuschalten, die auf dem Medium mit Pseudomonas solanacearum konkurrieren und die Entwicklung des Erregers beeinflussen könnten. Es ist möglich, daß einige Stämme schlecht wachsen, da die Bestandteile des Mediums auch einen Einfluß auf die Zielorganismen haben können. Sorgfalt ist auch gefordert bei der Unterscheidung von Pseudomonas solanacearum von anderen Bakterien, die sich auf dem Medium entwickeln könnten. Der Selektivausstrich kann als einziger Screeningtest durchgeführt werden, doch bei einem negativen Testergebnis, das wegen einer Hemmung von Pseudomonas solanacearum durch andere Bakterien in dem Medium vermutet wird, ist ein zweiter Screeningtest durchzuführen. Am besten geeignet ist in solchen Fällen der IF-Test. (5) ELISA-Test Der ELISA-Test ist generell weniger sensitiv als der IF-Test (Nachweisgrenze von 104-105 Zellen je ml Kartoffelextraktpellet). Er ist preiswert und schnell, führt im allgemeinen aber eher zu falsch positiven Ergebnissen (Kreuzreaktionen) und zu falsch negativen Ergebnissen (Hemmung durch Phenolmoleküle im Kartoffelextrakt). Die Anforderungen an die Antiserumspezifität sind außerordentlich hoch. Der ELISA-Test kann nicht als einziger Screeningtest durchgeführt werden. (6) PCR-Test Der PCR-Test ist potentiell eine sehr sensitives Nachweisverfahren, obwohl der Test leicht durch Pflanzen- oder Knollenextraktbestandteile behindert werden kann, die zu falsch negativen Ergebnissen führen. Einige Kartoffelsorten enthalten mehr Inhibitoren als andere. Daher müssen diese Inhibitoren beseitigt werden. Eine Möglichkeit ist die Verdünnung, doch dabei werden die Populationen von Pseudomonas solanacearum ebenfalls verdünnt. In allen Phasen der Proben- und Testvorbereitung muß sehr sorgfältig gearbeitet werden, um eine Kontamination, die zu falsch positiven Ergebnissen führen würde, zu vermeiden. Falsch positive Ergebnisse können auch durch homologe Sequenzen anderer Organismen auftreten. Daher kann der direkte PCR-Test nicht als einziger Screeningtest verwendet werden. (7) Anreicherungstest Die Bebrütung von Kartoffelextraktpelletproben in einer semiselektiven Bouillon, wie z. B. modifizierte SMSA-Bouillon, ermöglicht die Vermehrung von Pseudomonas solanacearum. Noch wichtiger ist vielleicht, daß auf diese Weise auch potentielle Inhibitoren der ELISA- oder PCR-Tests verdünnt werden. Pseudomonas solanacearum in Anreicherungsbouillon kann also durch IF, ELISA oder PCR nachgewiesen werden. Direktausstriche von den angereicherten Bouillons werden nicht empfohlen. Diese Anreicherungsmethoden wurden nicht gründlich genug erprobt und getestet. Sie wurden hier nur wegen ihres hohen Potentials aufgenommen. Da aber noch relativ wenig Erfahrungen mit ihnen vorliegen, können sie nicht als einzige Nachweismethoden verwendet werden. (8) Bioassay-Test Dieser Test wird für die selektive Anreicherung von Pseudomonas solanacearum in Kartoffelextraktpellets in Wirtspflanzen verwendet und kann an Tomatenpflanzen oder Eierfrüchten durchgeführt werden. Er erfordert optimale Inkubationsbedingungen gemäß den Angaben dieser Methode. Bakterien, die Pseudomonas solanacearum auf dem SMSA-Medium hemmen, werden diesen Test höchstwahrscheinlich nicht beeinflussen. (9) Bestätigungstest(s) Eine Reinkultur von Pseudomonas solanacearum wird zuverlässig identifiziert durch mindestens einen der in Abschnitt II.4.1 genannten Tests in Kombination mit einem Pathogenitätstest (Abschnitt II.4.3). Die Stammcharakterisierung ist fakultativ, wird aber für jeden neuen Fall empfohlen. >ENDE EINES SCHAUBILD> ABSCHNITT II DIAGNOSE DER SCHLEIMKRANKHEIT BEI KARTOFFELPFLANZEN UND -KNOLLEN 1. Symptome der Schleimkrankheit Die Kartoffelpflanze In der frühen Phase der Infektion welken die Blätter an der Spitze der Pflanze bei hohen Temperaturen während des Tages und regenerieren nachts. Die Welke wird schnell irreversibel und führt zum Absterben der Pflanze. Das vaskuläre Gewebe in quer durchgeschnittenen Stengeln verwelkter Pflanzen kann braun werden, und aus der Schnittfläche tritt ein milchiges Exsudat aus oder kann leicht herausgedrückt werden. Wird ein durchgeschnittener Stengel senkrecht ins Wasser gehalten, treten aus den Gefäßbündeln Schleimfäden aus. Die Kartoffelknolle Die Kartoffelknollen sind am Nabelende quer durchzuschneiden. In der frühen Phase der Infektion zeigt sich eine glasig gelbe bis hellbraune Verfärbung des Gefäßbündelringes, aus dem nach einigen Minuten spontan oder bei Ausübung von leichtem Druck mit dem Daumen auf die Schale in der Nähe der Schnittfläche ein blasses, cremefarbiges Exsudat austritt. Später wird die Verfärbung deutlich braun, und die Nekrose kann sich bis ins parenchymatische Gewebe erstrecken. In fortgeschrittenen Stadien breitet sich die Infektion von den Nabelenden und den Augen aus, was zu rötlich-braunen, leicht eingesunkenen Läsionen auf der Schale führt. Aus ihnen kann Bakterienschleim austreten, an dem Bodenpartikel haften bleiben. 2. Schnell-Screeningtests Schnell-Screeningstests ermöglichen die vorläufige Diagnose. Verwende einen oder mehrere der nachfolgenden Tests: Gefäßbündeltest Ob in welken Kartoffelstengeln Pseudomonas solanacearum vorhanden sind, kann mit folgendem leichten Test festgestellt werden: Stengel kurz über dem Boden abschneiden, und die Schnittfläche in ein Becherglas mit Wasser halten. Kurz danach treten spontan Bakterienschleimfäden aus den Gefäßbündeln aus. Kein anderes Bakterium, das Gefäßinfektionen bei Kartoffelpflanzen verursacht, weist dieses Phänomen auf. Nachweis von Poly-ß-hydroxybutyrat-Granula (PHB) Die PHB-Granula in den Zellen von Pseudomonas solanacearum werden durch Anfärbung mit Nilblau A oder Sudanschwarz B sichtbar gemacht. Entweder einen Ausstrich des Exsudats oder des suspendierten Gewebes auf einem Objektträger oder einen Ausstrich von einer 48stuendigen Kultur auf YPGA oder SPA (Anlage 1) zubereiten. Ausstriche für positive Kontrollen eines Biovar-2-Rasse-3-Stamms und bei Bedarf für eine negative Kontrolle eines heterologen Stammes zubereiten und trocknen lassen. Die Unterseite des Objektträgers mehrmals schnell durch eine Flamme führen, bis der Ausstrich fixiert ist. Nilblautest 1. Fixierten Ausstrich mit 1%iger wäßriger Lösung von Nilblau A überspülen. 10 Minuten bei 55 °C inkubieren. 2. Färbelösung ablaufen lassen. Kurz unter fließendem Leitungswasser abwaschen. Überschüssiges Wasser mit Papiertüchern aufnehmen. 3. Ausstrich mit 8%iger wäßriger Essigsäure überspülen. 1 Minute bei Raumtemperatur inkubieren. 4. Unter schwach fließendem Leitungswasser abwaschen. Mit Papiertüchern trockenlöschen. 5. Mit einem Tropfen Wasser wieder befeuchten. Deckglas auflegen. 6. Gefärbten Ausstrich unter einem Epifluoreszenzmikroskop bei 450 nm unter Ölimmersion und bei einer Vergrößerung von 1 000 betrachten. Auf kräftig orangefarbene Fluoreszenz von PHB-Granula achten. Auch bei Normallicht betrachten, um sicherzustellen, daß die Granula intrazellulär sind und die Zellmorphologie typisch für Pseudomonas solanacearum ist. Sudanschwarztest 1. Fixierten Ausstrich mit 0,3%iger Sudanschwarz-B-Lösung in 70%igem Ethanol überspülen. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 2. Färbelösung ablaufen lassen. Kurz unter Leitungswasser abwaschen. Überschüssiges Wasser mit Papiertüchern aufnehmen. 3. Ausstrich kurz in Xylol tauchen. Mit Papiertüchern trockenlöschen. Achtung! Xylol ist gesundheitsschädlich. Im Abzug arbeiten. 4. Ausstrich mit 0,5%igem (w/v) wäßrigem Safranin überspülen und 10 Sekunden bei Raumtemperatur belassen. Achtung! Safranin ist gesundheitsschädlich. Im Abzug arbeiten. 5. Unter schwach fließendem Leitungswasser abwaschen. Mit Papiertüchern trockenlöschen. Deckglas auflegen. 6. Gefärbten Ausstrich im Durchlichtmikroskop unter Ölimmersion bei einer Vergrößerung von 1 000 betrachten. PHB-Granula in Zellen von Pseudomonas solanacearum sind blau-schwarz gefärbt. Die Zellwände sind rosa gefärbt. Andere Tests Als andere Screeningtests eignen sich der IF-Test (Abschnitt III.2), der ELISA-Test (Abschnitt III.3) und der PCR-Test (Abschnitt III.4). 3. Isolierungsverfahren 3.1. Das Exsudat oder Bereiche verfärbten Gewebes vom Gefäßbündelring in der Knolle oder von den Gefäßsträngen im Stengel entfernen. In einem geringen Volumen sterilen, destillierten Wassers oder 50 mM Phosphat-Puffer suspendieren und 5-10 Minuten stehenlassen. 3.2. Mindestens zwei Dezimalverdünnungen, >NUM>1/>DEN>10 und >NUM>1/>DEN>100, der Suspension herstellen oder bei Bedarf mehr. 3.3. Ein Standardvolumen der Suspension und der Verdünnungen auf ein Universalnährmedium NA, YPGA und SPA (Anlage 1) und/oder auf das Kelman's Tetrazolium-Medium (Anlage 1) und/oder auf das selektive SMSA-Medium (Anlage 7) überführen. Mit einem geeigneten Verdünnungsausstrichverfahren ausspateln oder ausstreichen. Es kann günstig sein, einen Satz separater Platten mit einer verdünnten Zellsuspensionskultur eines Biovar-2-Rasse-3-Stamms von Pseudomonas solanacearum als positive Kontrolle anzulegen. 3.4. Die Platten 3 Tage bei 28 °C bebrüten. Bei langsamem Wachstum kann bis zu 6 Tagen bebrütet werden, wobei aber die Kolonien auf SMSA-Medium atypisch werden und absterben können. Auf den Universalnährmedien bilden virulente Isolate von Pseudomonas solanacearum perlweiße, flache, unregelmäßige und fluessige Kolonien, oft mit charakteristischen Wirbeln. Auf Kelman's Tetrazolium-Mediun bilden virulente Isolate von Pseudomonas solanacearum typische cremefarbene, flache, unregelmäßige, fluessige Kolonien mit blutrot gefärbtem Zentrum. Avirulente Formen von Pseudomonas solanacearum bilden dagegen butterartige, dunkelrote Kolonien. Virulente Isolate von Pseudomonas solanacearum bilden auf dem SMSA-Medium milchig-weiße, flache, unregelmäßige und fluessige Kolonien mit blutrot gefärbtem Zentrum. Avirulente Formen von Pseudomonas solanacearum bilden weniger fluessige Kolonien, die vollständig rosa bis rot auf dem SMSA-Medium erscheinen. 3.5. Kolonien mit charakteristischer Morphologie durch Subkultur auf einem Universalnährmedium reinigen. Regelmäßiges Subkultivieren, das zum Verlust der Virulenz führen könnte, ist zu vermeiden. 4. Bestätigungstest(s) 4.1. Identifizierung von Pseudomonas solanacearum Identifiziere Reinkulturen von Pseudomonas solanacearum durch zumindest eines der nachfolgenden Verfahren: Nähr- und enzymatische Tests Hinweis: In jeden Test geeignete Kontrollstämme einbeziehen. Es wurden Tests ausgewählt, die entscheidende Bedeutung für die Bestimmung von Art und Biovar haben. Folgende phänotypische Eigenschaften von Pseudomonas solanacearum sind universell vorhanden oder abwesend: >PLATZ FÜR EINE TABELLE> Medien und Methoden sind Lelliott & Stead (1987) zu entnehmen. IF-Test Eine Suspension von 106 Zellen je ml von der Kultur und dem(n) Kontrollstamm(stämmen) zubereiten. Eine Reihe von Zweifachverdünnungen des Antiserums zubereiten. Das IF-Verfahren anwenden (Abschnitt III.2). Der IF-Titer der Kultur muß dem der positiven Kontrolle entsprechen. ELISA-Test Eine Suspension von > 106 Zellen je ml von der Kultur und von dem(n) Kontrollstamm(stämmen) zubereiten. Das ELISA-Verfahren anwenden (Abschnitt III.3). Der Extinktionswert der Kultur muß dem der positiven Kontrolle entsprechen. PCR-Test Eine Suspension von 106 Zellen je ml von der Kultur und von dem(n) Kontrollstamm(stämmen) zubereiten. Das PCR-Verfahren anwenden (Abschnitt III.4). Das PCR-Produkt der Kultur muß die gleiche Größe und das gleiche Restriktionsenzymanalyse (REA)-Muster haben wie das der positiven Kontrolle. Fluoreszenz-in-Hybridisierung (FISH) Eine Suspension von 106 Zellen je ml von der Kultur und von dem(n) Kontrollstamm(stämmen) zubereiten. Das FISH-Verfahren (van Beuningen et al., 1995) mit dem PCR-Primer OLI-1 (Seal et al., 1993) anwenden. Die Kultur muß die gleiche Reaktion aufweisen wie die positive Kontrolle. Proteinprofil Denaturierte Proteine ganzer Zellen werden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) getrennt (Stead, 1992a). Bestimmung des Fettsäureprofils (FAP) Die Kultur und eine positive Kontrolle 48 Stunden bei 28 °C auf Trypticase-Soja-Agar wachsen lassen und das FAP-Verfahren anwenden (Janse, 1991: Stead, 1992a; Stead, 1992b). Das Profil der Kultur muß mit dem der positiven Kontrolle identisch sein. Charakteristische Fettsäuren unter den angegebenen Bedingungen sind 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH und 18:1 2OH. 4.2. Stammcharakterisierung Die Stammcharakterisierung ist fakultativ, wird aber für jeden neuen Fall unter Anwendung von zumindest einem der nachfolgenden Tests empfohlen. Biovarbestimmung Pseudomonas solanacearum wird nach der Fähigkeit, aus drei Zuckeralkoholen und drei Zuckern Säuren zu bilden, in Biovare eingeteilt (Hayward, 1964, 1994): >PLATZ FÜR EINE TABELLE> Durch zusätzliche Tests kann Biovar 2 in Subphänotypen unterschieden werden (Hayward, 1994): >PLATZ FÜR EINE TABELLE> Rassenbestimmung Die Rasse (Buddenhagen et al., 1962) wird auf der Grundlage eines Pathogenitätstests an Tomatenpflanzen oder Eierfrüchten und an Tabakpflanzen sowie durch einen Hypersensitivitätsreaktionstest (HR) an Tabakblättern (Lozano und Sequeira, 1970) bestimmt: >PLATZ FÜR EINE TABELLE> Die Bestimmung der Rasse mit dem Pathogenitätstest oder dem Hypersensitivitätstest an Tabak muß nicht sehr zuverlässig sein und kann anhand der Bestimmung des Biovars und des ursprünglichen Wirtes erfolgen. Die Kultur kann weiter charakterisiert werden durch: Genetischen Fingerabdruck Die molekulare Unterscheidung von Stämmen des Pseudomonas-solanacearum-Komplexes kann erfolgen durch: RFLP-Analyse (Cook et al., 1989). Repetitive Sequenz PCR [REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995)]. 4.3. Pathogenitätstest Dieser Test dient zur Bestätigung der Diagnose von Pseudomonas solanacearum und der Bestätigung der